Витрификация эмбрионов что это


Неприкосновенный запас

В современном обществе появился такой феномен, как отложенное материнство. Женщины хотят получать образование, делать карьеру, путешествовать, искать партнера мечты — и рожать не раньше 40 лет. Для того чтобы дети были здоровыми, врачи рекомендуют провести витрификацию яйцеклеток.

ЧТО ЭТО ТАКОЕ? 

Витрификация — самый эффективный и современный метод заморозки яйцеклеток, эмбрионов и овариальной (яичниковой) ткани для использования в будущем. С возрастом возможность естественного зачатия снижается, а риски невынашивания беременности и хромосомных аномалий у эмбрионов увеличиваются. Например, у 32-летней женщины при гормональной стимуляции вызревает обычно 15-20 яйцеклеток, из которых 10-14 могут быть успешно оплодотворены и из них 4-8 эмбриона — пригодны для использования. А 40-летняя женщина может рассчитывать лишь на 4-15 яйцеклеток, поэтому в лучшем случае можно получить 3 пригодных эмбриона, а в худшем — ни одного. Это значит весь цикл ЭКО в случае с яйцеклетками 32-летней женщины имеет 50% шансов на успех, а в случае с яйцеклетками 42-летней женщины — только 20%. После того как о заморозке своих ооцитов объявили Ким Кардашьян и София Вергара, количество желающих воспользоваться этой услугой резко возросло. 

ИСТОРИЯ МЕТОДА 

Японский доктор Масашиге Куваяма изобрел метод витрификации на криотопах в 2000 году. С тех пор он использовался более 500000 раз по всему миру в более чем 1200 клиниках 40 стран с неизменно прекрасны- ми результатами. Доктор Куваяма создал первый в мире банк человеческих ооцитов (яйцеклеток) и получил первого ребенка на витрифицированных эмбрионах в Японии в 2002 году и в США в 2003 году. Основным преимуществом витрификации по сравнению с методом медленной заморозки является то, что внутри яйцеклетки (состоящей, как и эмбрион, преимущественно из воды) не образуются кристаллы льда, которые могут повредить ее при «оттаивании». 95 эмбрионов из 100 после цикла «заморозки-оттаивания» сохраняют свою жизнеспособность. При медленной заморозке жизнеспособными оставалось только 50% эмбрионов. 

КОМУ ЭТО РЕКОМЕНДОВАНО? 

Помимо здоровых женщин, откладывающих материнство на будущее, витрификация помогает женщинам стать мамами в случае: 

— плановых операций при доброкачественных опухолях яичников и матки; 

— химио- или лучевой терапии по поводу онкологических заболеваний; 

— повышенного риска развития синдрома гиперстимуляции яичников после проведения индукции суперовуляции в цикле ЭКО — для последующей пересадки в полость матки. 

— во всех случаях, когда вероятность имплантации эмбриона в полости матки снижена, например, при наличии полипа эндометрия, недостаточной толщине эндометрия к моменту переноса эмбриона, дисфункциональном кровотечении. 

ВИТРИФИКАЦИЯ ПРИ ЭКО 

У 50% пациенток после ЭКО могут оставаться эмбрионы для криоконсервации. Цикл замораживания и переноса размороженных жизнеспособных эмбрионов обойдется значительно дешевле, чем проведение нового цикла ЭКО. Кроме того, в ряде исследований была выявлена более высокая частота наступления беременности и родов после переноса витрифицированных эмбрионов по сравнению с переносом свежих эмбрионов в стимулированном цикле — это связано с «гормональным взрывом» во время стимуляции овуляции (когда растет не один фолликул, а несколько), что может негативно отражаться на эндометрии и приводить к раннему закрытию «окна имплантации». Более того, беременность, наступившая в стимулированном цикле, чаще осложняется такими проблемами, как гестационный сахарный диабет, гипотиреоз, гестоз и другие.

Мнение эксперта 

АННА АНДРЕЕВНА ПОВАРОВА, кандидат медицинских наук, врач акушер-гинеколог отделения ЭКО Перинатального медицинского центра. 

— В каком возрасте лучше всего прибегнуть к витрификации? 

— Если женщина по каким-либо причинам приняла решение о сохранении фертильности, то тут рекомендация врачей одна — чем раньше, тем лучше! В среднем, оптимальным возрастом для сохранения фертильности (витрификации ооцитов, эмбрионов, овариальной ткани) является 30-35 лет. Но у каждой пациентки этот вопрос всегда рассматривается индивидуально. 

— Сколько лет могут храниться замороженные ооциты? 

— Витрифицированные ооциты могут храниться сколько угодно долго. Главное, чтобы сохранялись оптимальные условия для их хранения. 

— Безопасна ли сама процедура витрификации для женщины? 

— Для того чтобы витрифицировать ооциты, женщина должна пройти курс гормональной стимуляции (около 10 дней уколов), в конце которой ей предстоит малая операция — пункция яичников. Конечно, некий дискомфорт пациентка может испытывать, но на качество жизни это не влияет. 

— Какой возрастной предел для женщины для того, чтобы воспользоваться своими замороженными яйцеклетками и самостоятельно выносить ребенка? 

— Если женщина соматически здорова, не имеет противопоказаний к вынашиванию беременности и родам, готова стать мамой, то этот возраст может достигать и 45, и 48, и даже 50 лет.

mamadeti.ru

Протеинсинтез - Замораживание эмбрионов по протоколу Z-VIT

Иллюстрированная методика витрификации эмбрионов

c использованием набора реагентов Z-VIT

Набор реагентов для замораживания зигот-морул (Z-VIT) предназначен для криоконсервации эмбрионов человека, полученных in vitro. Криоконсервации подлежат эмбрионы (зиготы, стадии дробления или морулы) только хорошего качества. Эмбрионы, имеющие различные аномалии (отставание или остановка в развитии, фрагментация, неравномерное развитие бластомеров и др.), криоконсервации не подлежат. Набор рассчитан на проведение 10 процедур замораживания.

Для замораживания эмбрионов по протоколу Z-VIT необходимы следующие предметы:

  • 1) набор реагентов для замораживания зигот-морул Z-VIT;
  • 2) соломинка для витрификации;
  • 3) среда для манипуляций вне CO2-инкубатора (HEPES-буфер)1;
  • 4) шприцы стерильные 2–5 мл для набора растворов;
  • 5) 4-луночный планшет для витрификационных растворов;
  • 6) чашка Петри большая (90–100 мм);
  • 7) фломастер по стеклу тонкий для маркировки планшета и соломинки;
  • 8) капилляры для манипуляций с эмбрионами (140–300 мкм) и устройство для их заполнения («стриппер», «микроаспиратор» и пр.);
  • 9) таймер;
  • 10) пинцет для погружения соломинки в жидкий азот;
  • 11) ножницы остроконечные медицинские для вскрытия обжимных колпачков;
  • 12) спирт и марлевый тампон;
  • 13) ёмкость с жидким азотом.

Прим.1 : Любая среда с буфером HEPES или MOPS, например: COOK Gamete buffer, ORIGIO Flushing medium, FERTIPRO Flushing medium, SAGE Quinn’s medium with HEPES, VITROLIFE G-MOPS.

Процедура замораживания эмбрионов методом витрификации (протокол Z-VIT)

1. Перед первым использованием набора вскройте защитные колпачки на флаконах. Для этого обработайте колпачок этиловым спиртом и с помощью ножниц удалите крышечку защитного колпачка. Обнажившуюся резиновую пробку таким же образом обработайте спиртом.

2. Приготовьте 4-луночный планшет для выдерживания эмбрионов в витрификационных растворах. Промаркируйте крышку и дно таким образом, чтобы по надписи можно было идентифицировать пациентку, чьи эмбрионы предстоит заморозить.

3. Заполните планшет растворами с помощью стерильных шприцев. В центр планшета внесите 1,5–2 мл HEPES-буфера (любая среда с буфером HEPES или MOPS). В первую лунку планшета внесите 0,5 мл HEPES-буфера. Во вторую лунку внесите 0,5 мл раствора Z-VIT №1. В третью лунку внесите 0,5 мл раствора Z-VIT №2. В четвертую лунку внесите 0,5 мл раствора Z-VIT №2.

Схема заполнения планшета растворами представлена на рисунке:

4. Оставьте планшет нагреваться на термостоле ламинарного шкафа или в инкубаторе (минимум 10 мин).

5. Приготовьте соломинки для витрификации из расчета: 1–3 эмбриона на одну соломинку. Сделайте маркером надпись на соломинке. При нанесении надписи расположите соломинку верхним концом слева. Укажите фамилию пациентки, номер соломинки, идентификационный номер пациентки.

6. Приготовьте ёмкость с жидким азотом. Удобно использовать пенопластовый стакан, пенопластовую коробку или широкогорлый металлический термос. Ёмкость с жидким азотом разместите в непосредственной близости от ламинарного шкафа.

7. Эмбрионы, отобранные для криоконсервации, поместите в первую лунку планшета. Если эмбрионы до этого культивировали под маслом, желательно не допустить попадания масляного пятна в лунки планшета. Для этого можно воспользоваться центральным резервуаром планшета, где аккуратно вывести эмбрионы из-под масляного пятна и перенести их новым капилляром в первую лунку. Пока эмбрионы находятся в первой лунке (HEPES-буфер), можно распределить эмбрионы по группам для замораживания в соломинках. Также можно сделать фотографии для базы данных.

8. Подготовьте соломинку: внутреннюю часть соломинки поместите на стерильную крышку от большой чашки Петри (90–100 мм); внешнюю часть соломинки (чехол) поместите в ёмкость с жидким азотом.

9. Эмбрионы, подготовленные для замораживания в одной соломинке, поместите последовательно в растворы набора Z-VIT. Для этого воспользуйтесь капилляром 140–300 мкм. В растворе Z-VIT №1 выдержите эмбрионы 30–60 сек. В растворе Z-VIT №2 выдержите эмбрионы 2–3 мин. В растворе Z-VIT №3 выдержите эмбрионы 1 мин. Учтите, что растворы набора Z-VIT имеют возрастающую плотность, поэтому эмбрионы всплывают на поверхность раствора; с помощью капилляра опускайте эмбрионы на дно. В растворе Z-VIT №3 следует хорошо отмыть эмбрионы от предыдущего раствора.

Во время нахождения эмбрионов в растворах Z-VIT можно наблюдать в микроскоп, как клетки эмбрионов сжимаются вследствие обезвоживания, – это нормальное явление.

10. Поместите эмбрионы на соломинку. Для этого наберите эмбрионы в капилляр (140–300 мкм) таким образом, чтобы эмбрионы располагались в самом кончике капилляра. Отодвиньте планшет в сторону и поместите под стереомикроскоп крышку чашки Петри с соломинкой. Под контролем стереомикроскопа поместите эмбрионы на лепесток соломинки в небольшом объёме раствора Z-VIT №3.

11. Капля раствора с эмбрионами, помещаемая на лепесток, не должна быть большой (диаметр капли около 0,5 мм), тем не менее нет необходимости отбирать обратно в капилляр часть раствора, добиваясь экстремально малого объёма капли. Располагайте каплю на расстоянии 1–2 мм от кончика лепестка. Процедуру помещения эмбрионов на лепесток соломинки необходимо проделать в течение 30–60 сек.

12. Погрузите соломинку в жидкий азот. Удерживая пинцетом предварительно охлажденный чехол, погрузите в него внутреннюю часть соломинки. Допускается два варианта надевания чехла. В первом варианте соломинка охлаждается в жидком азоте, а затем под жидким азотом на неё надевается чехол.

Во втором варианте соломинка погружается непосредственно в охлажденный чехол.

13. Если замораживание эмбрионов осуществляется в нескольких соломинках, повторите действия, описанные в пунктах 8–12, пока все отобранные для криоконсервации эмбрионы не будут заморожены.

14. Соломинки с эмбрионами перенесите в криохранилище и расположите в сосуде Дьюара.

Вариант методики с погружением соломинки непосредственно по адресу хранения

Раствор Z-VIT №3 обладает малой критической скоростью охлаждения, это позволяет запечатывать крионоситель (соломинку) до погружения в жидкий азот и погружать соломинку непосредственно в бокал (гоблету) по адресу хранения в сосуде Дьюара. При таком варианте методики пункт 12 следует выполнить следующим образом:

15. Закройте соломинку в соответствии с рекомендациями производителя соломинки. Безотлагательно поместите соломинку в пенал (визотубу) бокала (гоблеты) по адресу будущего хранения.

Вариант методики витрификации «в каплях»

Вместо 4-луночного планшета допускается использование чашки Петри. При этом растворы вносят в чашку Петри в форме капель. Следует учесть, что капли растворов в чашке Петри быстро подсыхают и увеличивают свою осмолярность, поэтому капли не должны быть маленькими (диаметр 8–10 мм), а использовать подготовленную чашку следует в течение 15 мин. после приготовления. Удобно использовать большую чашку Петри (90–100 мм). Раствор Z-VIT №3 следует нанести в виде 2 капель, чтобы тщательнее отмыть эмбрионы от раствора Z-VIT №2. Для этого эмбрионы последовательно споласкиваются в двух каплях.

По всем вопросам использования Набора реагентов обращаться по тел. +7 (495) 532-59-64 или электронной почте Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

vitrification.ru

Криоконсервация

Краеугольным процессом в работе эмбриологической лаборатории Клинического госпиталя на Яузе является замораживание (криоконсервация) половых клеток и эмбрионов, полученных в циклах экстракорпорального оплодотворения, для их хранения и использования в будущем. Глубокое замораживание в жидком азоте (температура достигает - 196 градусов) позволяет обеспечить сохранение всех функций клеток и тканей после размораживания.

Технология криоконсервации незаменима при использовании вспомогательных репродуктивных технологий. Специалисты нашего госпиталя успешно пользуются криоконсервированным материалом как пациентов, так и доноров с высокой вероятностью достижения желанной беременности у супружеских пар с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения.

Главной проблемой криоконсервации является то, что при замораживании вода внутри клеток превращается в кристаллы льда, тем самым повреждая их. Вследствие этого процедура криоконсервации проводится с применением особых веществ, так называемых криопротекторов, которые забирают всю воду, содержащуюся в клетках, и тем самым исключают формирование кристаллов льда, способных нарушить жизнеспособность клеток.

Виды криоконсервации

 
Медленное программируемое замораживание

Данный способ подразумевает ступенчатое охлаждение с параллельным обезвоживанием клеток с помощью специального прибора, что снижает вероятность появления ледяных кристаллов внутри клетки и ее повреждения. Эффективность данного вида замораживания на сегодняшний день не является достаточной для успешного сохранения яйцеклеток и эмбрионов. В основном этот метод криоконсервации используют для замораживания сперматозоидов.

Витрификация

Этот метод сверхбыстрого замораживания является сегодня наиболее передовым и эффективным. Витрификация основана на использовании криопротекторов высокой концентрации и мгновенном снижении температуры до - 196 градусов. Плюсом данного способа является возможность улучшения сохранности яйцеклеток, практически без снижения их способности к оплодотворению. Накопленный опыт в проведении витрификации позволяет специалистам эмбриологической лаборатории Клинического госпиталя на Яузе достичь более чем 90% результативности при размораживании яйцеклеток. Эффективность витрификации эмбрионов еще выше и достигает 99%, что является безусловно высоким показателем.

Что именно криоконсервируют

В Клиническом госпитале на Яузе криоконсервации подвергают следующие виды биологического материала:

  • Яйцеклетки (ооциты). Возможно замораживание как донорских яйцеклеток, так и собственных ооцитов пациентки для сохранения репродуктивной функции в случае прохождения ею лечения, способного нарушить репродуктивную функцию (облучение или химиотерапия). Также криоконсервация яйцеклеток проводится при прогнозируемом снижении овариального резерва (при желании отложить материнство, наличии профессиональных вредностей, предстоящем оперативном лечении и т. д.).
  • Сперматозоиды. Замораживают сперматозоиды пациента при прохождении им терапии, способной нарушить репродуктивное здоровье, при работе на вредном производстве, для накопления сперматозоидов при их недостаточном количестве для процедуры ЭКО, а также если мужчина не может сдать сперму в день забора яйцеклеток. Замораживание донорской спермы проводят с целью создания банка донорских половых клеток.
  • Эмбрионы. Замораживанию подвергаются эмбрионы, которые были получены в результате программы ЭКО, но не перенесены в матку пациентки. Замороженные эмбрионы можно использовать для достижения последующих беременностей или для повторного переноса эмбрионов при неудачной предыдущей попытке ЭКО. Кроме того, они могут быть использованы в качестве донорского материала, если пара отказывается от своих криоконсервированных эмбрионов и дает согласие на это.

www.yamed.ru

«Сравнительная эффективность витрификации и программной крио консервации эмбрионов КРС полученных методом in vitro»

Известно, что биологические материалы такие как интактные эмбрионы, при обычных условиях подвержены изменениям и разрушению. Использование низких температур для длительного хранения зародышей повсеместно востребованный биотехнологический метод. Доказано, что при достижении критической температуры, известной также как температура «стеклования» составляющая -130°C образец может храниться неопределенно долгое время при практически полном отсутствии биохимических процессов.

Сохранение зародышей столь долгое время открывает для исследователей широкий спектр возможностей и позволяет создавать обширные хранилища «эмбриобанки» где могут храниться десятки тысяч эмбрионов редких и исчезающий пород, так и видов животных. Что позволяет проводить как фундаментальные исследования, а также сохранять и восстановить генетическое разнообразие.

Развитие зародыша в искусственной среде имитирующей жидкости яйцевода к сожалению, не в полной мере обеспечивает потребности зародыша в макро и микроэлементах, витаминах и аминокислотах. Известно, что эмбрионы, полученные методом in vitro обладают более низким функциональным статусом. Клеточная масса эмбриобласта и трофобласта ниже чем у эмбрионов, полученных классическим методом in vivo. В следствии чего эмбрионы более восприимчивы к крио повреждениям и требуют применения более деликатных методов криоконсервации позволяющих гарантированно сохранить качество эмбриона.

В связи с чем для определения оптимального протокола и метода заморозки нами были проведены ряд опытов по сравнению методов крио консервации, а также растворов криопротекторов.

 Для опыта использовали доимплонтированные эмбрионы КРС полученные из ооциткумулюсных комплексов. Ооциткумулюсные комплексы извлекали прижизненно методом TAU (транс вагинальной аспирации) из антральных фолликулов яичников коров доноров. Поиск и морфологическую оценку осуществляли на стереомикроскопе лабораторного класса, Olympus SZ51 при 16 кратном увеличении. Для дозревания  ооцитов  использовали  среду  199  (Medium 199, Hepes modification, 25mM.) с добавлением 10%  эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота, Na-пирувата,  BSA, 1.0 ЕД  /  мл  лютенизирующего гормона, 10 ME/мл, фолликулостимулирующего гормона,  1,0мкг  /  мл  эстрадиола (спиртовой раствор) и  50 мкг / мл гентамицина.

Для оплодотворения использовали среду Fert-TALP и  разделённое по полу  криоконсервированное семя быков. Для оплодотворения яйцеклетки перемещались в лунки со средой объёмом 80 мкл.  И инкубировались совместно со сперматозоидами в течении 18-20 часов при  температуре  38,5-39  в  атмосфере с содержанием 5  %  CO2. После оплодотворения зиготы отмывали в растворе SOF и механически удаляли клетки кумулюса посредством пепетирования при помощи наконечников для денудации ооцитов диаметром 135 мкм. Очищенные зиготы помещались в среду на основе SOF  c добавлением BSA, MEM vitamins,   MEM Niaa, MEM iaa в лунки планшетов объёмом 500 мкл, покрытые минеральным маслом  (  Sigma ,США)  и культивировали при температуре 38,5º С  в увлажненной  атмосфере  под газовой  фазой (по  5% CO2  и  O  2  и  90 % N2) в течение 7-8 суток. Для опыта использовали эмбрионы только отличного качества находящихся на стадии развития от BL-II ( поздняя бластоциста) до BL-IV (полностью Экспандированная Выход доимплонтированных бластоцист от числа поставленных на созревание яйцеклеток составил 29,42%

Криоконсервация опытных образцов осуществлялась на штатном замораживателе фирмы «CRYOLOGIC» модель CL 5500

Рис 1

И при помощи готовых наборов криопротекторов для витрификации фирмы «Криотек». Насыщение эмбрионов криозащитными растворами проводили по следующей ссхеме.

Таблица 1

№ п/п

Наименование крипротектора

Кол-во ступений насыщения

Время насыщения

Мин.

Носитель

№ программы

Способ криоконсервации

1

EG-1,5 М

1

10

Пайета 0,25 мл

1

CL5500

2

EG-1,8 М

1

10

Пайета 0,25 мл

1

CL5500

3

GL-1,4 М

2

15

Пайета 0,25 мл

1

CL5500

4

EG-DMSO

2

13

криотоп

-

Для криоконсервации эмбрионов 1, 2 и 3 группы использовали программу где начало охлаждения идёт с + 20˚С, охлаждение ведётся со скоростью 2˚С/мин. до -6 ˚С далее индукция кристаллизации и выдержка при этой температуре в течении 10 мин, далее охлаждение до -35˚С со скоростью 0,5˚С/мин. После завершения цикла заморозки пайеты с эмбрионами переносились в жидкий азот и хранились при температуре -196ºС.

Четвёртая группа замораживалась витрификацией где в качестве криопротектора использовали стандартный раствор фирмы «Криотек»

Насыщение эмбрионов криопротектором осуществляли по схеме, приведённой на Рис. 2

Рис 2. Схема насыщения эмбриона криопротектором для витрификации

После проводки в растворе криопротектра эмбрион помещался на носитель «криотоп» и погружался в жидкий азот (N2).

Оттаивание пайет с эмбрионами 1,2 и 3 групп производилось в водяной бане при температуре +37ºС. Эмбрионы криоконсервированные методом витрификации оттаивались по схеме, представленной на рис. 2

Рис.3 Девитрификация эмбрионов

Морфологическая оценка производилась на стереомикроскопе Olympus SZ 51 при 40 кратном увеличении. Эмбрионы оценённые как пригодные после выведения криопротектора помещались с среду SOF.

Таблица 2 Результаты испытаний

№ п/п

Кол-во бластоцист

Метод криоконсервации

Наименование криопротектороа

Кол-во пригодных после оттаивания n-%

1

96

програмная

EG-1,5 М

67

69,50%

2

84

програмная

EG-1,8 М

50

59,44%

3

93

програмная

GL-1,4 М

68

71,03%

4

77

витрификация

EG+DMSO

75

97,40%

Исходя из данных Таблицы 2 можно сделать вывод, что наилучший результат сохранности показали эмбрионы 4 группы крио консервированные витрификацией из 77 замороженных эмбрионов 75 получили оценку как пригодные, что составило 97,40%. Наименьший результат сохранности показали эмбрионы крио консервированные в 1,8 М этиленгликоле, что составило 50 пригодных эмбрионов или 59,44%. Эмбрионы замороженные в 1,5 М этмленгликоле и 1,4 М глицерин заняли промежуточное положение.

Выводы:

Основываясь на результатах проведённых исследований можно сделать вывод, что метод витрификации позволяет достигать минимальных потерь при заморозке эмбрионов и составил 2,6 %. На данный момент ведутся работы по разработке системы витрификации на прямую пересадку.

apknews.su


Смотрите также